• 14 de septiembre de 2015
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Luces y sombras de la tecnología que permite editar el genoma (CRISPR/Cas9)

Sandra Rodríguez Perales y Raúl Torres ambos del Grupo de Citogenética Molecular del CNIO plantean beneficios y limitaciones de estas investigaciones.

El sistema CRISPR es un mecanismo de auto-defensa o “inmunidad adaptativa” utilizado por algunas bacterias para protegerse frente al ataque de virus o plásmidos invasores. En la naturaleza (wild type) existe o se ha desarrollado como un mecanismo de defensa de las bacterias (organismos procarióticos) contra agentes patógenos externos que tratan de introducir su propio material génico en ellas (virus principalmente). El sistema consiste en una serie de repeticiones de DNA exógeno que incorporan dichos microorganismos a modo de inmunidad adquirida, lo que les ofrece una mayor rapidez de respuesta en sucesivas infecciones y la detección del agente patógeno; la manera de neutralizar el material génico de este (DNA) es mediante el reconocimiento de dichas secuencias en el DNA invasor y su acoplamiento con la nucleasa (Cas9) que se encarga de su degradación.

Recientemente, este sistema bacteriano ha sido reestructurado para utilizarlo como herramienta biotecnológica de ingeniería genómica, explotando sus características nativas. En definitiva, el sistema CRISRP/Cas9 se está utilizando para modificar de forma dirigida, rápida y eficiente el genoma de muchas especies diferentes (y, teóricamente, cualquier especie).

A pesar de ser una tecnología muy reciente (los primeros artículos describiendo el uso de este sistema como herramienta de ingeniería genómica son del año 2013), cada vez aparecen más publicaciones utilizando este sistema. Se han descrito estudios en los que se ha usado el sistema CRISPR para generar modelos animales y celulares de diversas patologías y también para variadas aplicaciones biotecnológicas.

Estas potencialidades no solo abren enormes posibilidades a nivel de investigación básica y clínica, sino que también plantean algunas dudas y controversias éticas, especialmente tras el reciente anuncio de un grupo de investigadores chino que aseguraba haber procedido a la edición génica germinal en seres humanos.

En España, diferentes grupos de investigación están avanzando en esta prometedora línea de trabajo; entre ellos, miembros del Grupo de Citogenética Molecular del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO) cuentan ya con una dilatada experiencia y plantean beneficios y limitaciones de estas investigaciones.


Sandra Rodríguez Perales, investigadora del grupo de Citogenética Molecular del CNIO

“La verdadera revolución del sistema CRISPR es que ha permitido, por primera vez, realizar experimentos de edición genómica de forma fácil y eficiente”


- ¿En qué consiste la técnica del CRISPR/Cas9?

El sistema CRISPR/Cas9 se basa en la expresión de un RNA de cadena sencilla (sgRNA) que actúa como guía dirigiendo a una nucleasa (Cas9) hacia un locus de DNA, donde la nucleasa Cas9 induce una rotura de doble hebra. En una primera etapa, la nucleasa Cas9 y el sgRNA se acomplejan, el sgRNA dirige al complejo a la región diana del DNA siguiendo las reglas clásicas de apareamiento de núcleotidos descritas por Watson y Crick. Una vez localizada la región target, la nucleasa Cas9 induce una rotura de doble hebra en el DNA, lo que activa el sistema de reparación celular, hecho que se traduce en la edición genómica.            

"Este nuevo modo de reconocimiento de DNA ha revolucionado el campo de la edición génica"
 
La rotura del DNA puede ser reparada por dos sistemas celulares distintos: (i)  sistema de unión de extremos no homólogos (non-homologous end joining ó NHEJ  en inglés), asociada a cambios o errores en la región reparada; (ii) o, si existe una  molécula de DNA que pueda ser usado como molde para la reparación, mediante la reparación dirigida por homología (homology directed repair ó HDR), vía de reparación libre de errores.


     "El sistema CRISPR permite editar varias regiones del genoma al mismo tiempo" 


- ¿Qué ventajas ofrece este sistema?

Las ventajas del sistema CRISPR frente a otras herramientas previas de  edición genómica, como las ZFNs o TALENs (las cuales se basan en el reconocimiento de la región de DNA diana a modificar mediante una interacción DNA-proteína),  es que en el caso del sistema CRISPR es un RNA de cadena sencilla (sgRNA) el que dirige a la nucleasa Cas9 a su sitio target.

Este nuevo modo de reconocimiento de DNA ha revolucionado el campo de la edición génica, ya que ha eliminado la necesidad de tener que generar dominios proteicos para interaccionar con el DNA, facilitando enormemente el proceso de edición genómica. Otra de las ventajas del sistema, es que permite editar varias regiones del genoma al mismo tiempo (multiplexing), simplemente utilizando varios sgRNAs que dirijan a la Cas9 nucleasa a distintos loci.                         


- ¿Qué ofrece, desde el punto de vista investigador y clínico, este novedoso sistema?

Ya hay publicados numerosos estudios en los que se aplica el sistema CRISPR para modelar diversos tipos de neoplasias (tanto neoplasias hematológicas como tumores sólidos). Estos modelos de neoplasias reproducen tanto mutaciones puntuales concretas como reordenamientos cromosómicos más complejos (translocaciones, inversiones o deleciones), tanto in vitro (en tipos celulares específicos) como in vivo (ratones transgénicos o modificación tejido específica en animales adultos). El sistema se ha utilizado para estudios funcionales mediante la generación de líneas célulares isogénicas, en los que se altera un gen cada vez o una combinación de varios genes al mismo tiempo. Siguiendo un paso más allá, el sistema CRISPR se puede adaptar para realizar ensayos funcionales más complejos mediante procesos robotizados o de “high throuput screening”.

Además, el sistema CRISPR se ha utilizado con éxito en muchas especies (ratón, rata, zebrafish, primates, plantas…), abriendo la posibilidad de editar el genoma de especies en las que hasta la actualidad no se podía hacer. Otra interesante (y revolucionaria) aplicación de este sistema es la capacidad que ofrece para manipular embriones directamente, acelerando significativamente la generación de animales transgénicos.
                                    
 "Ya hay publicados numerosos estudios en los que se aplica el sistema CRISPR para modelar diversos tipos de neoplasias"

-¿Realmente estamos ante un sistema capaz de "editar" los genes problemáticos?

El sistema CRISPR está en sus inicios. Investigadores de todo el mundo estamos desarrollando y explorando nuevas vías y aproximaciones para usar este sistema, que se está utilizando cada vez de modo más específico y eficiente, lo que facilita su uso en una variedad de contextos biológicos.

El hecho de que este sistema se base en las reglas de hibridación de ácidos nucleicos de Watson y Crick para reprogramar la especificidad de Cas9 simplifica significativamente las aplicaciones de edición genómica, especialmente si tenemos en cuenta que los sgRNA son fáciles de sintetizar e introducir dentro de las células facilitando el proceso de edición genómica.

Parece que lo que hay hecho hasta la fecha es solo la punta del iceberg: estamos ante una revolución de la ingeniera genómica, con una apertura de las posibles aplicaciones y modos de empleo de esta técnica.
                        
"Este sistema ofrece la posibilidad de manipular embriones directamente, acelerando significativamente la generación de animales transgénicos"


- ¿Por qué cree que ha despertado tanto interés esta tecnología del "edición de genes"?

La verdadera revolución del sistema CRISPR es que es una herramienta que ha permitido, por primera vez, realizar experimentos de edición genómica de forma fácil y eficiente. Hasta la aparición de esta nueva tecnología existían otras herramientas de edición, pero éstas eran mucho más complejas de utilizar y estaban asociadas a un proceso de diseño y manejo muy laborioso y costoso, tanto en tiempo como en dinero. Además estos sistemas (dada su baja eficiencia) estaban acoplados a sistemas de selección que normalmente dejaban “huella” en el genoma editado. Las eficiencias de edición asociadas al uso de las CRISPR permiten prescindir del uso de estos sistemas de selección, con lo que las células/animales modificados no contienen ninguna huella debida al proceso de edición, una característica muy importante en el caso de su uso para ensayos de terapia génica.

Esto abre un campo particularmente interesante cuando se combina con la cantidad de información que las secuenciaciones genómicas masivas están aportando, así como de las nuevas metodologías de síntesis de ácidos nucleicos y de mecanismos para introducirlos en las células.
La revolución CRISPR va asociada a un crecimiento exponencial en el número de publicaciones en las que se usa este sistema desde el año 2013. Muy probablemente estos estudios son el inicio de una nueva era en el campo de la edición genómica.
                                    
"Estamos ante una revolución de la ingeniera genómica, con una apertura de las posibles aplicaciones y modos de empleo de esta técnica"

- ¿Y qué sucede con las posibles implicaciones ético-morales que ofrece esta nueva tecnología?

Las controversias éticas del uso del sistema CRISPR están relacionadas con el proceso de modificación de la línea germinal humana. En un artículo publicado en abril, científicos de China describieron el uso del sistema CRISPR para editar el genoma de embriones humanos (afectando potencialmente a la línea germinal). Aunque en este caso los embriones no eran viables, el hecho de haberlos editado inició un debate ético acerca del uso de esta herramienta. Se ha especulado con la necesidad de regular la edición genómica de embriones humanos. Lo que no está claro si esto debería ser indefinido o hasta que se conozcan las consecuencias reales asociadas a estos procesos.    
                                   
"Las controversias éticas del uso del sistema CRISPR están relacionadas con el proceso de modificación de la línea germinal humana"

 


Raúl Torres. Colaborador científico del Grupo de Citogenética Molecular del Centro Nacional Investigaciones Oncológicas (CNIO)

“Si en este momento existe algún gen problemático, dada la evolución y rapidez de utilización del sistema CRISPR, en breve estaremos en posición de poder editarlo”

 - ¿Por qué el sistema CRISPR/Cas9 puede ser aprovechado para la edición de genes?

Su desarrollo como herramienta de edición génica/genómica se basa en la idea de aprovechar el potencial de reconocimiento por parte del RNA guía y la rotura de la hebra de DNA por parte de la nucleasa; esto ha facilitado enormemente la implementación de dicha tecnología, pues hasta la fecha la manera de llevarlo a cabo era mediante el desarrollo de complejas proteínas, que tenían que ser completamente rediseñadas para cada secuencia de DNA que se quisiera editar (modificar, delecionar o insertar). Sin embargo, esta nueva herramienta biotecnológica ofrece la posibilidad de utilizar la misma proteína, y la forma de otorgarle especificidad es mediante la utilización de secuencias de RNA de 20 nucleótidos, cuyo único requerimiento (en el caso de CRISPR/Cas9 de S. Pyogenes) es una secuencia adyacente con el formato NGG.    


"El sistema ofrece una gran sencillez y versatilidad en su implementación"

 - ¿Qué trascendencia clínica puede tener?

El sistema ofrece una gran sencillez y versatilidad en su implementación; como he dicho, el único  requerimiento que tiene es la presencia de una secuencia NGG y no hay que hacer ingeniería de proteínas, como ocurría hasta ahora con ZFN y TALENs donde, aparte de la secuencia de reconocimiento, se tenía que tener en consideración el plegamiento de la proteína y las posibles variaciones de su estructura y de qué manera esto afectaba a su centro activo y a su acoplamiento a la doble hebra de DNA.

"Ofrece la posibilidad de generar modelos de enfermedades hasta ahora no disponibles en la clínica, la posibilidad de modificar genes defectuosos e incluso se ha abierto la ingeniería genética a especies que hasta la fecha eran difícilmente modificables"

- Con este sistema se solventa este aspecto, ¿no?

Sí, puesto que la proteína (en principio) no se modifica (es cierto que se han generado fusiones con distintos dominios activadores y represores, e incluso la inactivación de uno o los dos centros activos que cortan en las dos cadenas de DNA). Lo único que es necesario variar es la secuencia de RNA (sgRNA) de reconocimiento del target deseado.
                       "Hasta la fecha se han publicado más de 1000 artículos científicos en los cuales se han modificado multitud de genes"

- ¿Y qué más beneficios aporta desde el punto de vista del investigador?

Aparte de ofrecer sencillez y versatilidad (puntos clave para el investigador básico), ofrece la posibilidad de generar modelos de enfermedades hasta ahora no disponibles en la clínica, la posibilidad de modificar genes defectuosos e incluso se ha abierto la ingeniería genética a especies que hasta la fecha eran difícilmente modificables, como son células humanas primarias, primates, ratas, pez cebra e incluso distintas especies de plantas, con su posible implicación biotecnológica y por ende medioambiental y ética.
                       "Estamos ante un sistema que cualquiera puede implementar en su laboratorio, simplemente comprando unos plásmidos de Addgene y con software disponible en Internet"

- Pero, ¿hasta qué punto son trasladables estos avances en la edición de genes a la práctica clínica?

Cuando se publican resultados científicos, es difícil saber hasta qué punto todo es tan ideal como parece. Pero, por la experiencia propia y la de distintos colegas en el campo, parece que no hay casi ninguna restricción en su utilización. Hasta la fecha se han publicado más de 1000 artículos científicos (términos de búsqueda en pubmed CRISPR & 2013 to present) en los cuales se han modificado multitud de genes, de los más variopintos organismos o especies. Por lo tanto, si en este momento existe algún gen problemático, dada la evolución y rapidez de utilización del sistema, en breve estaremos en posición de poder editarlo.
                                   
 "En un plazo moderado de tiempo (y si no aparecen estudios en contra) podría ser que se llegara aplicar con fines terapéuticos"

- ¿Está justificado este entusiasmo, es decir, hay bases científicas y clínicas que sugieran su futuro interés y aplicación clínica?

El principal motivo, bajo mi punto de vista, es la facilidad y rapidez que ofrece, a la par que las probabilidades de éxito que implica. Hasta la fecha, el campo de la edición génica parecía reservado a unos pocos que tenían o el dinero (se trataba de una serie de herramientas bastante caras y casi siempre problemáticas) o la tecnología para llevarlo a cabo. En el caso de las ZFN, aunque se intentó un proyecto “opensource”, no ha cuajado dada la dificultad de su aplicación y diseño exitoso; en el caso de las TALEN, se consiguió una semi-universalización, aunque no siempre con probabilidades de éxito, por lo que a la postre su diseño recaía en empresas especializadas que disponían de la patente o licencias de ellas. En este caso, sin embargo, estamos ante un sistema que cualquiera puede implementar en su laboratorio, simplemente comprando unos plásmidos de Addgene (repositorio de DNA plasmídico) y con software disponible en Internet; con ello, y algo de experiencia en cloning, se puede poner a punto en pocas semanas, lo que antes llevaba meses (en el mejor de los casos).

"Hay que tener en cuenta pros y contras y evaluar si su aplicación ofrece algún beneficio versus su no utilización"

En mi opinión, aunque hay que esperar a ver como sigue evolucionando esta tecnología, sí que es verdad que genera alrededor de ella una atmósfera entusiasta. Esto es así, además de por todo lo que se ha comentado anteriormente, porque se está trabajando en la manera idónea de hacer su entrega en los distintos organismos y se han hecho grandes avances en la prevención de lo que parecía su talón de Aquiles (los efectos off-target -no deseados-), por lo que en un plazo moderado de tiempo (y si no aparecen estudios en contra) podría ser que se llegara aplicar con fines terapéuticos (en este caso hay que tener cautela, por que a lo largo de los años, muchas herramientas biotecnológicas han estado en este punto, pero posteriormente se ha demostrado que tenían efectos adversos difícilmente asumibles).

- Aunque también deberían superarse y resolverse algunas controversias que se plantean a nivel ético…

Por supuesto, todo nuevo avance tanto en ciencia como en tecnología siempre conlleva algún tipo de controversia; es cierto que pueden plantearse consideraciones éticas entorno a su utilización, al igual que hasta la fecha han estado asociadas con el uso de las células madre embrionarias, la terapia génica o la implementación de la inteligencia artificial. En mi opinión, el punto medio está en aplicarlo (el uso del sistema) con cautela y esperar a ver cuales son los pasos convenientes a la hora de modificar la línea germinal u organismos que posteriormente pueden ser liberados al medio ambiente, es decir, tener en cuenta pros y contras y evaluar si su aplicación ofrece algún beneficio versus su no utilización.
 
"Los grupos de investigación han mostrado un gran interés en este sistema y se está desarrollando la tecnología en diversos laboratorios"

- ¿Se tiene ya una amplia experiencia con esta técnica en nuestro país?

Lo cierto es que los grupos de investigación han mostrado un gran interés y se está desarrollando la tecnología en diversos laboratorios, pero hasta la fecha los que cuentan con cierta ventaja son el grupo de FJ Mojica (Univ. Alicante), uno de los pioneros en el estudio del sistema “wild type”; y en cuanto a su aplicación, destacaría el grupo de L. Montoliú (CNB), el nuestro (Juan Carlos Ramírez y Raúl Torres) y el de la Dra. Rodríguez-Perales (CNIO).